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    研究方案
miRNA可以與mRNA結合調節體內基因的表達,通過影響蛋白的表達、修飾、酶活性等來調節生命活動的進行。lncRNA作為體內的ceRNA,可以與miRNA結合起到調節基因表達的作用。研究lncRNA與miRNA的相互作用對于研究生命具有重要的意義。通過MS2-RIP和靈敏度更高的雙熒光素酶技術,來研究lncRNA和miRNA的相互作用。

MS2-RIP

MS2-RIP技術主要是應用針對GFP抗體的Protein G磁珠把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA 進行q-PCR驗證或者測序分析。

技術流程

  • 載體構建及轉染
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  • 細胞裂解液獲取
    及磁珠的準備
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  • RNA結合蛋白免疫沉淀
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  • RNA純化
  •  
  • RNA反轉錄及cDNA驗證
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  • 數據分析

案例展示

圖. MS2- RIP實驗原理圖(表達Lnc-A的質粒富集miRNA1miRNA2的效率比不表達Lnc-A的MS2組明顯提高。通過對照,說明MS2-A可以與miRNA1和miRNA2相互結合)


雙熒光素酶報告系統

雙熒光素酶報告基因通常是一個報告基因作為內對照,使另一個報告基因的檢測均一化。金開瑞應用Promega 公司的雙熒光素酶報告基因檢測(DLR)系統,提供DLR 檢測服務。

技術流程

  • 序列分析
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  • 合成或者擴增目的片段
    亞克隆至目標載體
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  • 報告基因質粒、轉錄因子共轉染細胞
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  • 熒光素酶反應發光
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  • 結果分析

案例展示

圖. 雙熒光素酶和RIP驗證lncRNA可以與miR-26a結合

(引自C Cao, Zhang T, Zhang D. et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. )

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