非編碼RNA（Non-coding RNA）是指不編碼蛋白質的RNA。其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 、microRNA 和lncRNA等多種已知功能的 RNA，還包括未知功能的RNA。
長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度＞200bp的RNA，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，lncRNA具有保守的二級結構,大部分不編碼蛋白質。LncRNA發揮功能的方式很廣，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調控。主要包括基因組表觀遺傳修飾、調控轉錄后翻譯、發揮ceRNA、增強子RNA作用等，從而對細胞的增殖、分化、遷移、凋亡、免疫等發揮調控作用。
金開瑞提供的非編碼RNA服務：miRNA、lncRNA、tRFs
研究方案（以lncRNA為例）
1、采用二代測序或芯片技術找出不同組樣本差異表達的lncRNA
圖1. LncRNA 差異表達聚類結果及差異表達火山圖
2、lncRNA/miRNA篩選驗證
采用RT-PCR或者qRT-PCR檢測lncRNA/miRNA在不同組織和細胞中的表達水平。
圖2. PVT1和 miRNA在宮頸癌組織中的表達
(Iden, M.et al.The lncRNA PVT1 Contributes to the Cervical Cancer Phenotype and Associates with Poor Patient Prognosis.PloS one.2016.May 27;11(5))
3、細胞系鑒定
采用對肝癌細胞（如hepG2、hep3b、huh7）STR位點和Amelogenin位點的基因分型技術，進行細胞鑒定。
| Marker | 細胞庫信息 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Allele1 | Allele2 | Allele3 | Allele1 | Allele2 | Allele3 | |
| D5s818 | 13 | 13 | 13 | 13 | ||
| D13s317 | 10 | 11 | 12 | 14 | ||
| D7s820 | 10 | 11 | 12 | 14 | ||
| D16s539 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| VWA | 16 | 18 | 17 | 17 | ||
| TH01 | 7 | 7 | 6 | 7 | ||
| AMEL | X | X | X | X | ||
| TPOX | 8 | 11 | 9 | 9 | ||
| CSF1PO | 11 | 11 | 8 | 8 | ||
| D21S11 | 30 | 30 | ||||
4、lncRNA功能及下游靶標分子研究
4.1、構建lncRNA/miRNA的過表達（基因敲除）穩轉癌細胞株；
圖3. 基因過表達/敲除后單克隆細胞株的篩選
圖4. CRISPR/Cas9和慢病毒穩定細胞系
4.2、MTT/CCK8法測定細胞生長活力；
圖5. 轉染TP53TG1 減少了細胞的活力
（Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.）
4.3、流式細胞檢測細胞凋亡；
圖6. HCT-116 cells 穩定轉染TP53TG1 24小時后檢測細胞的凋亡率
（Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.）
4.4、軟瓊脂克隆形成實驗；
圖7. TP53TG1 抑制了HCT-116細胞的克隆形成
（Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 22;113(47):E7535-E7544.）
4.5、細胞劃痕實驗；
圖8. 傷痕愈合實驗檢測 VIM 敲低和過表達對細胞侵襲力的影響
（Peng Zheng,Quantitative Proteomics Analysis Reveals Novel Insights into Mechanisms of Action of Long Non-coding RNA HOTAIR in Hela Cells.MCP. 2015.）
4.6、細胞體外Matrigel侵襲實驗；
圖9. 與siCONT細胞相比，siPVT1細胞侵襲力明顯降低
(Iden, M.et al.The lncRNA PVT1 Contributes to the Cervical Cancer Phenotype and Associates with Poor Patient Prognosis.PloS one.2016.May 27;11(5))
4.7、Western blot檢測腫瘤相關蛋白表達。
圖10. 用不同濃度的EW-7197 (0.25, 0.5, 1.25 and 2.5 μM) 處理A549-CUG2 and BEAS-CUG2 細胞24 h。免疫印跡檢測 CUG2, E-cadherin, N-cadherin, and vimentin 的表達
（Kaowinn S, Kim J, Lee J, Shin DH, et, al. Cancer upregulated gene 2 induces epithelial-mesenchymal transition of human lung cancer cells via TGF-β signaling. Oncotarget. 2016 Dec
5、蛋白質組學尋找調控的下游靶標分子
應用蛋白質組學iTRAQ（SILAC,SWATH）定量方法和生物信息學找到lncRNA/miRNA調控的靶標。
圖11. 蛋白質組學ITRAQ/SWATH 和差異蛋白通路分析
6、采用FISH技術研究lncRNA在細胞中定位分布
圖12. 目的lncRNA在細胞中的位置分布（18S和U6為內參）
7、lncRNA作用機制研究
7.1、采用體外轉錄技術，RNA pull down, LC- MS等技術手段檢測與RNA互作的蛋白質。
圖13. RNA pull down后質譜鑒定、WB檢測
7.2、RIP驗證與蛋白質結合的lncRNA或者lncRNA與miRNA的互作
圖14. AP-1蛋白與RNA的相互作用RIP
圖15. MS2- RIP實驗原理圖（表達Lnc-A的質粒富集miRNA1miRNA2的效率比不表達Lnc-A的MS2組明顯提高。通過對照，說明MS2-A可以與miRNA1和miRNA2相互結合）
7.3、雙熒光素酶基因檢測miRNA和lncRNA/mRNA的互作情況
生物信息學預測分析
圖16. 利用生物信息學方法預測lncRNA與miRNA的結合位點
雙熒光素酶和RIP驗證
圖17. 雙熒光素酶和RIP驗證lncRNA可以與miR-26a結合
（C Cao, Zhang T, Zhang D, et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. ）
8、動物實驗
8.1、成瘤模型
圖18. 肝癌裸鼠成瘤模型，通過活體成像和測量觀察不同處理小鼠腫瘤的生長、轉移情況
（C Cao, Zhang T, Zhang D, et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. ）
8.2、普通藥物模型或基因治療模型
8.3、模式動物：CRISPR/Cas9敲除或敲入的模式動物
圖19. 腺病毒注射小鼠尾靜脈后，隔一段時間通過肺組織切片觀察某基因對肺的影響
8.4、損傷修復模型
如骨斷裂恢復模型
圖20. 小鼠骨斷裂后用SEC2處理，X-ray拍攝結果顯示SEC2組小鼠恢復更快
(Xu J, Wu T, Sun Y, et al.Staphylococcal Enterotoxin C2 Expedites Bone Consolidation in Distraction Osteogenesis. J Orthop Res. 2017 Jun;35(6):1215-1225. )
參考文獻
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2、Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 2003 Jun;3(6):453-8.
3、Oca?a OH, Córcoles R, Fabra A, et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 2012 Dec 11;22(6):709-24.
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5、Faghihi MA, Modarresi F, Khalil AM, et al. Expression of a noncoding RNA is elevated in Alzheimer's disease and drives rapid feed-forward regulation of beta-secretase. Nat Med. 2008 Jul;14(7):723-30.
