miRNA可以與mRNA結合調節體內基因的表達，通過影響蛋白的表達、修飾、酶活性等來調節生命活動的進行。lncRNA作為體內的ceRNA，可以與miRNA結合起到調節基因表達的作用。研究lncRNA與miRNA的相互作用對于研究生命具有重要的意義。通過MS2-RIP和靈敏度更高的雙熒光素酶技術，來研究lncRNA和miRNA的相互作用。
MS2-RIP
MS2-RIP技術主要是應用針對GFP抗體的Protein G磁珠把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA 進行q-PCR驗證或者測序分析。
技術流程
- 載體構建及轉染
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- 細胞裂解液獲取
及磁珠的準備
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- RNA結合蛋白免疫沉淀
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- RNA純化
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- RNA反轉錄及cDNA驗證
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- 數據分析
案例展示
圖. MS2- RIP實驗原理圖（表達Lnc-A的質粒富集miRNA1miRNA2的效率比不表達Lnc-A的MS2組明顯提高。通過對照，說明MS2-A可以與miRNA1和miRNA2相互結合）
雙熒光素酶報告系統
雙熒光素酶報告基因通常是一個報告基因作為內對照，使另一個報告基因的檢測均一化。金開瑞應用Promega 公司的雙熒光素酶報告基因檢測(DLR)系統，提供DLR 檢測服務。
技術流程
- 序列分析
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- 合成或者擴增目的片段
亞克隆至目標載體
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- 報告基因質粒、轉錄因子共轉染細胞
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- 熒光素酶反應發光
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- 結果分析
案例展示
圖. 雙熒光素酶和RIP驗證lncRNA可以與miR-26a結合
（引自C Cao, Zhang T, Zhang D. et al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. ）
蛋白與核酸的相互作用廣泛存在于生命活動的調節中。基因的復制、轉錄、翻譯、修飾等過程都離不開核酸和蛋白的互作。金開瑞提供RNA pull down+質譜、雙熒光素酶、染色質免疫共沉淀、凝膠遷移或電泳遷移率檢測（EMSA）、酵母單雜交、DNA pull down等技術來檢測DNA/RNA與蛋白的相互作用。
RNA pull down
蛋白質與RNA 的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質合成、mRNA 組裝、病毒復制、細胞發育調控等。金開瑞現提供RNA pull down 檢測技術服務, 使用特異性二抗進行檢測，能有效避免抗體重鏈對結果的信號干擾。并且金開瑞配套自己的質譜平臺，能顯著提升檢測效果。
技術流程
- RNA探針標記
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- 胞漿蛋白提取
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- 與磁珠結合、洗脫
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- WB檢測或者質譜鑒定
案例展示
圖. pull down下來的蛋白銀染圖
根據膠上條帶的差異情況和實驗目的，選擇質譜或者WB鑒定pull down下來的蛋白
圖. SDS-PAGE電泳后質譜鑒定
DNA Pull down
DNA pull down是用于分析蛋白質與DNA互作的一種分析技術。該實驗首先需要針對待研究目的基因的調控區域設計并制備特異性探針。同時，制備細胞核提取物；將探針和核提取物共同孵育，DNA結合蛋白就會和靶向序列特異性結合。然后，通過親和素磁珠純化蛋白質DNA復合物。最后針對獲得的蛋白，使用WB驗證或者質譜方式鑒定蛋白質類型。
技術流程
- 采用基因組DNA做模板，經PCR擴增特定片段
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- 將其克隆至克隆載體，并測序鑒定成功
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- 使用PCR法或末端標記法標記探針
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- 標記的探針利用凝膠回收試劑盒純化回收探針，并檢測探針濃度
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- 細胞核物質分離提取與探針孵育
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- 探針蛋白復合物洗脫與純化
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- WB蛋白驗證或者質譜鑒定
技術應用
Examples of the liquid chemiluminescent DNA pull-down assay.
(引自Iwasaki T, Miyazaki W, Rokutanda N. et al. Liquid chemiluminescent DNA pull-down assay to measure nuclear receptor-DNA binding in solution. Biotechniques. 2008 Oct;45(4):445-8.)
RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）
RIP（RNA 結合蛋白免疫沉淀）主要是運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA 進行q-PCR驗證或者測序分析。金開瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗證RIP技術服務。
技術流程
- 載體構建及轉染
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- 細胞裂解液獲取
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- 磁珠的準備
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- RNA結合蛋白免疫沉淀
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- RNA純化及鑒定（測序）
案例展示
使用目的蛋白尋找驗證RNA（蛋白/RNA互作）
染色質免疫共沉淀技術（ChIP）
ChIP染色體免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于體內分析發展起來的方法，也稱結合位點分析法，這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。
技術流程
- 細胞固定
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- 染色質斷裂
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- 染色質免疫沉淀
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- 交聯反應的逆轉
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- DNA的純化
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- DNA的鑒定
案例展示
A. Rapid increase of histone acetylation in silent genes caused by HDAC inhibitor treatment.
B. The ChIP-Seq signals for the DIPA gene (active) and FOSL1 gene (silent) were displayed.
(引自Wang Z, Zang C, Cui K, et al. Genome-wide mapping of HATs and HDACs reveals distinct functions in active and inactive genes. Cell. 2009 Sep 4;138(5):1019-31.)
凝膠遷移或電泳遷移率檢測（EMSA）
凝膠遷移或電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測蛋白質和DNA 序列相互結合的技術，可用于定性和定量分析。目前已用于研究RNA 結合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用，是轉錄因子研究的經典方法。金開瑞幫助您檢測DNA 結合蛋白、RNA 結合蛋白、特定的蛋白質，并可進行未知蛋白的鑒定。
技術流程
- 實驗設計
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- 合成探針
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- 生物素標記探針
及標記效率檢測
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- EMSA電泳凝膠配置
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- EMSA反應
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- 電泳檢測
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- 顯色反應
案例展示
The EMSA results of binding of AlgR to the rsmX/Y/Z promoter sequence.
（引自Li M, Yan J, Yan Y. The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5. Biochem Biophys Res Commun. 2017 May 20;487(1):173-180.）
酵母單雜交（Y1H）
將提取的樣品RNA 逆轉錄成單鏈cDNA,經長距離聚合酶鏈反應擴增得到雙鏈cDNA，再經CHROMA SPIN TE-400 柱子純化后與酵母表達載體pGADT7-Rec 線性質粒共轉至Y1HGold[pBait-AbAi]酵母感受態，經SD/-Leu/AbA 缺陷培養基篩選出與誘餌序列相互作用的獵物蛋白。
技術流程
- 總RNA提取
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- mRNA分離純化
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- cDNA單鏈的合成融合
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- cDNA雙鏈的的合成
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- 雙鏈cDNA的純化
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- 線性化pBait-AbAi質粒轉化
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- 單雜交cDNA文庫構建及篩選
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- PCR鑒定藍斑克隆中插入的cDNA片段
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- 抽提陽性克隆子prey質粒
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- 測序及驗證
案例展示
圖. 酵母單雜原理圖
Description of the Y1H screens approach conducted with Zat12 promoter segments as baits.
(引自Ben Daniel BH, Cattan E, Wachtel C, et al. Identification of novel transcriptional regulators of Zat12 using comprehensive yeast one-hybrid screens. Physiol Plant. 2016 Aug;157(4):422-41.)
蛋白是生命活動的執行者，可以以單一分子或者復合體形式執行生命活動。蛋白分子間相互作用是蛋白分子組建復合體、執行功能的一個途徑。金開瑞可以提供免疫共沉淀、GST pull down、酵母雙雜交技術檢測蛋白分子間的相互作用。其中，免疫共沉淀實驗結果具有更接近真實生理條件下蛋白相互作用信息的優點，配合GST pull down，可以研究蛋白之間是直接相互作用還是間接相互作用，而酵母雙雜對于研究低表達的蛋白、瞬時表達蛋白具有更高靈敏度的優點。
免疫共沉淀 (Co-IP）
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是將樣品中同抗體靶蛋白相互作用的蛋白一同隨免疫復合物沉淀，然后進行檢測的技術。通過免疫共沉淀可以檢測兩種目標蛋白質是否在體內存在相互作用（直接或者間接），免疫共沉淀后通過質譜技術也可以尋找一種蛋白在體內的相互作用蛋白。
技術流程
- 樣品準備
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- 樣品裂解、定量
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- 抗體、proteinA/G凝膠等準備
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- 沉淀收集、洗滌、制樣
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- WB檢測分析
技術運用
Co-IPs were carried out with anti-Tiam1 antibody from the lysates of the different SDC4 lines and the subsequent immunoblot was probed with anti-GFP-HRP (GFP::SDC4) or anti-Rac1 antisera, respectively. Tiam1,Rac1 and GFP::SDC4 were used as loading controls. The strongest interactions were detected in the Ser179Glu and ΔPDZ-Ser179Glu cell.
（引自Keller-Pinter A, Ughy B, Domoki M,et al. The phosphomimetic mutation of syndecan-4 binds and inhibits Tiam1 modulating Rac1 activity in PDZ interaction-dependent manner. PLoS One. 2017 Nov 9;12(11):e0187094.）
GST融合蛋白沉降（GST pull down）
Pull down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。
技術流程
- GST探針蛋白（互作蛋白）載體構建
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- 融合蛋白（互作蛋白）表達
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- 探針瓊脂樹脂孵育
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- Pulldown實驗
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- 互作蛋白鑒定
技術應用
GST pulldown assays were performed by incubating purified NF110a with GST, GST-APH-2 or GST-HBZ immobilised on GST resin. The eluates were analysed by immunoblot with anti-ILF-3 antibodies (left panel) and coomassie blue staining (right panel). NF110a input corresponds to 20% of total NF110a loaded to each pulldown.
（引自Murphy J, Hall WW, Ratner L, Sheehy N. Novel interactions between the HTLV antisense proteins HBZ and APH-2 and the NFAR protein family: Implications for the HTLV lifecycles. Virology. 2016 Jul;494:129-42.）
酵母雙雜交（Y2H）
酵母雙雜交技術最初由Fields等人在研究酵母轉錄因子GAL4性質時建立，后續經過不斷改進已發展成為一種成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，被廣泛應用于互作蛋白的篩選、蛋白相互作用的鑒定/驗證、蛋白互作機理的探究、蛋白連鎖圖譜繪制等工作。
技術流程
- 接收訂單及樣品
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- 總RNA提取
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- mRNA純化
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- 反轉錄
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- 雙鏈cDNA合成及純化
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- 共轉至酵母感受態細胞
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- 轉化效率測定
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- 文庫效價測定
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- 結果交付
案例展示
圖. 酵母雙雜原理圖
Identification of 14–3-3γ as a direct binding partner of Best1 in the yeast two-hybrid system.
（引自Oh SJ, Woo J, Lee YS,et al. Direct interaction with 14-3-3γ promotes surface expression of Best1 channel in astrocyte. Mol Brain. 2017 Nov 9;10(1):51.）
AP-SWATH
生物體內的蛋白質很少單獨行使功能，蛋白質之間會形成復合物來發揮功能。蛋白質間的相互作用是細胞中最基本的活動，被稱為互作蛋白質組（Interactome）。研究蛋白質組相互作用的方法主要有親和純化（AP）、化學交聯偶聯質譜CXMS）等方法。其中AP技術使用特別設計的純化標簽在非常接近于生理條件的情況下，能捕捉出特定的蛋白質及其分子伴侶。
技術流程
- 接收訂單及樣品
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- 親和純化產物
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- LC-MS/MS
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- 數據解析
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- 互作蛋白確定
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- 結果交付
案例展示
（引自Caron E, Roncagalli R, Hase T, et al. Precise Temporal Profiling of Signaling Complexes in Primary Cells Using SWATH Mass Spectrometry.[J]. Cell Reports, 2017, 18(13):3219）
