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知無不“研”,DNA pull down 常見疑點解析
文章來源:genecreate 作者:genecreate 發布時間:2020-11-17 10:11
DNA pull down 常見疑點解析
 
Q1 適配子DNA單鏈,可以用帶有互補鏈的磁珠進行pull down嗎?如果可以,效率怎么樣?一般需要怎么優化條件?
A:理論上說,若DNA單鏈能夠與磁珠上的互補鏈雜交成功,是可以進行pull down實驗的; 效率如何不好確定,這個取決于兩條DNA單鏈是否能雜交成功、蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。
 
Q2: DNA pull down的 原理?
A:針對目標區域設計特異性DNA探針并進行生物素標記,生物素探針可與偶聯在磁珠上的鏈霉親和素結合;細胞蛋白提取物與磁珠-DNA探針孵育,從而釣取與DNA探針有特異性結合的互作蛋白質。
 
Q3: 你們對外服務的檢測項目有哪些?
A:細胞、動物/植物組織、菌體都可以做DNA pull down, 我們還可以做的檢測實驗具體如下:
(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位:RNA pull down、RIP、fish等;
(2) DNA-蛋白互作:DNA pull down、ChIP、EMSA、雙熒光素酶、酵母單雜等;
(3) 蛋白-蛋白互作:GST/his pull down、CoIP、酵母雙雜等;
(4) 細胞學檢測:細胞增殖-MTT/CCK-8, 細胞凋亡, 細胞周期,細胞遷移、侵襲:劃痕愈合/Transwell/Transwell(Matrigel)等;
(5) 外泌體服務:提取、鑒定(Nanosight粒徑檢測/電鏡/WB)、
測序(miRNA/lncRNA)、蛋白質組學;
(6) 轉錄組及蛋白質組:真核有參轉錄組、無參轉錄組、真核lncRNA、small RNA等。
 
Q4:效率有多高?
A:效率主要取決于蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。
 
Q5:老師,對照組的DNA序列是怎么選擇的?
A:一般對照組是沒有探針的,對照組是磁珠beads+蛋白。
 
Q6:DNA pull down有什么缺陷嗎?
A:DNA pull down-MS是體外研究蛋白-DNA是否有直接互作的經典技術,是將探針結合在凝膠/磁珠上,釣取與DNA探針有互作的蛋白;就技術而言,沒有明顯的缺陷;后續質譜能鑒定到多少蛋白取決于蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。
 
Q7: 做DNA pulldown 用DNA單鏈好還是雙鏈好?
A:常規的是用DNA雙鏈作為探針。
 
Q8: 可以簡單講一下生物素標記引物的原理嗎?
A:主要利用生物素(biotin)和親和素(avidin)這兩種分子的獨特性質; 親和素的每個亞基都能結合一個生物素分子,兩者的結合是通過生物素的脲基環部分完成的;因此可將其戊酸側鏈通過酰胺鍵與核酸分子相連,構成生物素標記的核酸探針。
 
Q9: 如果做轉錄因子,轉錄因子和DNA結合發起轉錄,不應是和打開的單鏈結合嗎?
A:啟動子是位于轉錄起始位點(結構基因)5'端上游的DNA序列,就像"開關",決定基因的活動,本身并不控制基因活動,而是通過與特定蛋白質(轉錄因子)結合而控制基因的活動。轉錄因子就像一面"旗子",指揮著酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases) 的活動,這種酶制造著基因的RNA復制本。轉錄因子是與啟動子DNA雙鏈結合的。
 
Q10:做100bp突變對照組應該怎么突變堿基?
A:可以通過查找相關資料確定啟動子發揮功能的核心區域,將核心區域進行突變;一般是A/G互換,C/T互換突變。
 
Q11: DNA互補鏈可以相互釣取嗎?
A:DNA pull down 是研究蛋白-DNA的互作,不可以用DNA互補鏈相互釣取。
 
Q12:請問DNA為什么會與蛋白質互作呢,它們有什么功能的聯系嗎?
A:DNA pulldown 是研究蛋白-DNA的互作, 主要應用于尋找已知的啟動子序列所結合的未知蛋白(轉錄因子);啟動子是位于轉錄起始位點(結構基因)5'端上游的DNA序列,就像"開關",決定基因的活動,本身并不控制基因活動,而是通過與特定蛋白質(轉錄因子)結合而控制基因的活動。
 
Q13: 如果做小肽對細菌的作用是否也可以DNA pull down?
A:小肽屬于蛋白類, 做不了DNA pull down。
 
Q14:未加探針的對照組鑒定出蛋白是什么原因呢?
A:對照組是磁珠beads+蛋白,雖然沒有探針,但少量蛋白可以與磁珠相結合,對照組鑒定到的蛋白是非特異性的背景蛋白。
 
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