一、酵母單雜交
酵母單雜交技術是在酵母雙雜基礎上發展而來的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用于研究真核細胞內基因的表達調控，如鑒別DNA結合位點發現潛在的結合蛋白基因、分析DNA結合結構域信息等。
二、酵母雙雜交
酵母雙雜交及系統是一種鑒定和檢測蛋白質相互作用的研究方法，因其具有靈敏性高、功能強大、適用范圍廣等特點，現已被應用于多個研究領域。
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核蛋白酵母雙雜交：
核蛋白酵母雙雜交技術最初由Fields等人在研究酵母轉錄因子GAL4性質時建立，后續經過不斷改進已發展成為一種成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有簡便、靈敏、可反映蛋白在活細胞內互作真實情況的特點，被廣泛應用于互作蛋白的篩選、蛋白相互作用的鑒定/驗證、蛋白互作機理的探究、蛋白連鎖圖譜繪制等工作。
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膜蛋白酵母雙雜交：
DUALmembrane技術在傳統的酵母雙雜交系統的基礎上，巧妙地利用分離的泛素系統（split-ubiquitin）進行蛋白質相互作用的篩選；泛素作為降解信號分子，人為分成兩部分：N端（Nub），C端（Cub），互補重構的完整泛素分子可被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。
植物：自交不親和機理研究……
病毒：朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白篩選……
信號通路：轉錄因子、雌激素α受體相互作用蛋白篩選……
癌癥醫學：癌癥相關蛋白、凋亡相關蛋白相互作用蛋白篩選……
寄生蟲醫學：毒力因子致病機制研究、半乳糖凝集素互作蛋白篩選……
基礎原理研究：肌球蛋白、蛋白酶體調節因子相互作用蛋白篩選、受精卵發育……
一站式輔助檢測手段方便快捷，得到可靠的實驗結論；
多年文庫構建經驗，4種優化的Total RNA提取技術方案可以有效保證Total RNA的純度和完整性，保證樣本的多樣性；
| 文庫質量保證措施 | ||
|---|---|---|
| RNA質量 | 總RNA提取方案-TRIZOL | 適用細胞或者動物組織 |
| 總RNA提取方案-CTAB | 適用植物樣本中RNA含量超低的樣本 | |
| 總RNA提取方案-SDS | 適用淀粉含量高的樣本 | |
| 總RNA提取方案-試劑盒 | 適用多糖多酚含量高的樣本 | |
高效的SM定向三框文庫構建技術可以保證文庫的陽性率在98%以上，且一份cDNA樣本連接三個不同的讀碼框載體可以輕松實現三框文庫的質控指標零差異，減少文庫差異對篩選結果的影響；
定向改造了pPR3-N系列載體為pPR3-GW載體，可以輕松實現核蛋白文庫到膜蛋白文庫的一步LR反應，獲得膜蛋白酵母雙雜交文庫。
| 實驗步驟 | 三種文庫構建策略比較 | ||
|---|---|---|---|
| Clontech的SMART技術 | invitrogene技術 | 專利的SM定向三框文庫技術 | |
| 雙鏈cDNA的純化方法 | Spin400純化柱子 | invitrogene DNA分子篩純化柱 | 改進的Spin1000純化柱子，兼顧了片段長度的同時保證樣本的回收率在80%左右，有效保證了文庫的滴度 |
| 雙鏈cDNA與載體的連接 | 利用酵母體內同源重組酶完成同源重組 | gateway方法 | 專利的SM定向三框文庫構建策略在原始商業化載體pGADT7和pPR3-N系列載體的基礎上改造了Sfi I和Smal I的酶切位點，用于零背景定向克隆目標cDNA片段。 |
| 文庫的交付形式 | 轉化到酵母細胞的文庫菌 | 轉化到大腸桿菌的文庫菌和文庫質粒 | 轉化到大腸桿菌的文庫菌和文庫質粒 |
| 文庫的用途 | 改變篩選方案之后可以實現文庫的多用途 | 可以方便的通過一步LR反應實現文庫的多用途 | 可以通過簡單的載體改造構建到任意想要的載體上 |
| 文庫的陽性率 | 90%左右 | 90%左右 | 98%以上 |
| 文庫的插入片段 | 800bp以上 | 1000bp左右 | 1200bp左右的集中分布 |
酵母單/雙雜交文庫構建
酵母單雜交文庫篩選
酵母雙雜交文庫篩選
酵母單雜交
| 服務項目 | 客戶提供 | 最終交付 |
|---|---|---|
| 文庫構建 | 組織/細胞 | 滴度在1×108以上的酵母文庫菌液； 文庫PCR鑒定結果圖片（陽性率在80%左右） |
| 文庫篩選 | promoter基因序列/質粒 | 篩選過程中的全部原始圖片； 篩選獲得所有相互作用的獵物蛋白的測序結果 |
針對酵母單雜交實驗結果，可作進一步驗證：
| 服務項目 | 實驗目的 | 細分 | 周期（工作日） |
|---|---|---|---|
| EMSA | 驗證啟動子和蛋白互作 | 探針合成及標記 | 10 |
| EMSA實驗 | 20 | ||
| 雙螢光素梅檢測 | 驗證啟動子和蛋白互作 | 載體構建 | 10-15 |
| 雙螢光素酶檢測 | 25 |
注：1. 雙螢光素酶檢測默認使用293T細胞，使用其他細胞視培養及轉染難度議價；
2. 雙螢光素酶檢測啟動子-轉錄因子驗證默認1個轉錄因子 + 啟動子序列WT和Mut各1個；microRNA靶基因驗證默認1個microRNA + 靶序列WT和Mut各1個，超過以上組合數量請詢價。
酵母雙雜交
| 服務項目 | 客戶提供 | 最終交付 |
|---|---|---|
| 文庫構建 | 組織/細胞 | 滴度在1×108以上的酵母文庫菌液； 文庫PCR鑒定結果圖片（陽性率在90%左右） |
| 文庫篩選 | 蛋白序列/基因序列/質粒 | 篩選過程中的全部原始圖片； 篩選獲得所有相互作用的獵物蛋白的測序結果 |
針對酵母雙雜交實驗結果，可作進一步驗證：
| 服務項目 | 實驗目的 | 細分 | 周期（工作日） |
|---|---|---|---|
| Co-IP | 驗證蛋白互作 | / | 20 |
| GST pull-down | 驗證蛋白互作 | GST pull-down+WB/銀染 | 20 |
文庫構建質控結果：
從質控的結果上看，文庫的插入片段分布在1500bp左右，陽性率為100%
高效的一步文庫篩選結果：
從文庫篩選質控結果上看，篩選到的陽性克隆片段大小不一，插入片段分布在800~1500bp。
從驗證結果上看，篩選到的陽性克隆與目的蛋白存在強的相互作用，說明篩選到的克隆確實為互作蛋白。
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